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[48]。既往有研究显示采用血管造影进行检测，但对于直径小于200um的则无法进行显影，因此很难用于真正的血管生成检测。近期，NL003的申办方提交了一项新的随机、对照、双盲临床试验（NCT05968118），计划拟入组36位患者，拟采用68Ga RGD PET/CT和99mTc MIBI SPECT成像方法评价药物对血管生成和下肢血流灌注的影响，该试验的开展有望对基因疗法治疗PAD提供更多的客观证据。 三、展望 基于促血管生长因子的基因疗法在临床转化中存在困难，提示新的基于TA的治疗策略需要开发。笔者在此对基因疗法在未来PAD的研究方向做出一些展望。 1. 基础研究揭示新的靶点 与单基因疾病相比，PAD发生发展机制更为复杂，我们对疾病的认识仍有待深入，因此持续探索PAD发生发展过程的病理机制和新靶点尤为重要。有关PAD的全基因组关联分析、代谢组学、蛋白质组学以及单细胞转录组学的数据相继公布，为疾病发生发展带来了更广泛以及更深入的认识[49-51]。一项纳入了31000名患者的全基因组关联研究发现几个可能对PAD发病机制有贡献的位点以及证实了已知与PAD风险因素相关的位点，包括与ABI相关的9p21变异体(rs1333045)、与2型糖尿病相关的TCF7L2变异体(rs7903146)，以及与高脂血症相关的几个位点[52]。近期PAD的蛋白质组学研究显示，缺氧导致线粒体呼吸蛋白堆积，降低了糖酵解限速酶活性，并增强整合应激反应来调节蛋白质翻译，这些机制可能成为疾病改善的新靶点[51]。 2. 非血管生长因子基因 最近的研究已经确定了表观遗传因素在血管生成和PAD的关键反应调控中的重要作用[53]。研究已经确定了非编码RNA作为PAD发病机制中组织缺血、血管生成与动脉生成、炎症以及祖细胞/干细胞动员的生物标志物和关键调节因子[54]。越来越多的研究显示，CLI的基因疗法失败可能不是由于生长因子缺乏，而是由于下游血管生成信号通路受损，这种效应有望通过使用非编码RNA治疗克服[54]。因此，利用非编码RNA进行基因治疗，比如通递送具有促进血管生成效应的miRNAs，或者通过抑制血管生成效应的miRNAs，可以被视为基因治疗性血管生成的一种新方向。例如，Krist等[55]使用基于腺相关病毒的过表达策略显示，在小鼠后肢缺血模型中，miR-378a具有促进肌肉细胞的血管生成反应以及骨骼肌再血管化的作用，有趣的是，作者发现上述作用仅在肌肉注射而非静脉注射后才会发生。此外，另有一项正在进行的随机、对照研究（NCT04110964）拟测试腺相关病毒载体转导人端粒酶逆转录酶基因（rTERT）在CLI中的安全性和有效性。该试验的理论背景在于利用rTERT的表达来延长端粒，进而阻止、延缓甚至逆转CLI的病理发展。 3. 联合疗法 由于血管生成是一个复杂且多步骤的过程，涉及许多不同的因素，单基因似乎很难启动协调的血管生成过程。为了增强基因治疗的效果，同时注射了几种具有血管生成效应的基因成为一种方案。在选择基因组合时，需尽量利用已有知识，考虑基因之间的现有相互作用数据[56]。我们的早期研究发现，神经因素参与下肢缺血的修复，为此构建了VEGF和神经生长因子（Nerve growth factor，NGF）的基因递送体系治疗下肢缺血，在动物实验中取得了一定效果[57]。近期一项临床研究将含双启动子的质粒pIRES/VEGF165/HGF注射到合并糖尿病的CLI患者下肢肌肉中，在治疗后90天，治疗组患者的血清VEGF水平和ABI显著增加，静息痛减少，CTA结果显示血流灌注明显改善[58]。然而，研究缺乏随机分组和盲法，需要进一步的研究来进行验证。使用基因与干细胞联合治疗或使用基因对干细胞进行改造可能会带来新的突破。近期，Kim等[59]通过慢病毒载体感染制备了持续高表达SDF-1α的工程化间充质干细胞（Mesenchymal stem cell，MSC）,并将其注射到小鼠缺血的后肢中，有效促进血管再生和骨骼肌修复。Huerta等[44]使用AAV将E-selectin导入骨髓来源的MSC，并使其获得高表达，随后在后肢缺血合并创面的小鼠模型中，高表达E-selectin的MSC显著增强了小鼠下肢的血管生成并促进了创面的愈合。 4. 微环境改善 多项研究显示，氧化应激参与了PAD的发生与发展并与肌肉损伤相关，骨骼肌的再生受损和局部促炎型巨噬细胞相关。此外，无论是在人体还是动物模型，均观察到了过量活性氧的产生以及氧化应激的激活[49, 60]。Lejay等[61]使用N-乙酰半胱氨酸来抑制小鼠后肢缺血模型中的氧化应激，改善了肢体的功能、骨骼肌显微形态以及线粒体呼吸功能。以上结果提示，缺血局部微环境并不利于组织的再生修复，逆转缺血微环境可能带来治疗的新突破。基因本身和缺血的微环境好比于“种子”和“土壤”的关系。因此“土壤改善”可能成为提升TA效率的新策略。本团队在此理论上也做出了一些工作，设计了一种能够实现活性氧清除的聚合物载体，用于递送CYP2J2基因、VEGF/NGF双基因来治疗小鼠后肢缺血。结果表明，相比于单纯基因递送，兼具微环境改善作用的基因递送体系更好地实现了血管生成和患肢的功能恢复[57, 62]。然而，微环境和再生修复之间的关系复杂，仍需要更好的策略来实现对缺血微环境的精细调控。 结语 早期动物实验和一些临床案例的成功，使TA在领域内受到了极大的关注，甚至被认为可能成为PAD治疗的新范式。然而，大规模的随机、对照研究并没有达到最初的设想，以至于冲淡了早期的热情。机遇总是和挑战并存，总的来看，PAD的治疗需求仍然巨大，当前的治疗方案远不能满足临床需求，因此基因治疗性血管生成仍具有广阔的开发前景。事实上，TA的理念也一直在指导着新方案的研发。设定合理的目标，回答关键的问题，深入认识PAD的发病机理，不断发现新的治疗靶点，将有助于我们更好地开发和改进。也许一个里程碑已近在眼前， 但TA在PAD治疗中探索远不会止步于此。 利益冲突：无利益冲突 参考文献 [1] SONG P, RUDAN D, WANG M, et al. National and subnational estimation of the prevalence of peripheral artery disease (PAD) in China: a systematic review and meta-analysis [J]. J Glob Health, 2019, 9(1): 010601.DOI:10.7189/jogh.09.010601. |
