|
[35]。 二、基因疗法TA面临的挑战 众多基于TA理念的方案在动物实验中显示出显著的治疗效果，却仅有极少数能进入临床验证，也尚无基因治疗产品得到了广泛的认可。故笔者在此列举了一些TA治疗下肢缺血从实验室走向临床验证、再从临床验证走向转化成功的潜在挑战。 1. 生长因子的生物学功能再认识 VEGF作为最经典的促血管生成因子，曾被认为是TA最有希望的“种子”。然而，近期研究发现， VEGFA在外显子8中的选择性剪切可导致具有“抗血管生成”特性的VEGFA亚型产生，这种可变剪接导致了6个氨基酸的转换，将“促血管生成”的VEGF165a转变为“抗血管生”成的VEGF165b异构体，而此前的研究无法对VEGF165a与VEGF165b进行区分[36]。另有研究显示，在PAD肌肉中，VEGF165b的表达量比VEGF165a增加了3倍，并且VEGF165b即使在10倍较低的浓度下也能抑制VEGFR1。这表明仅仅通过增加VEGF-A水平来获得的治疗效果可能在临床上并不可行，似乎是VEGF临床试验失败的原因之一[37]。 还有研究对生长因子补充的方案提出质疑，认为PAD进展的关键不在于生长因子缺乏。一些直接的证据显示，下肢缺血患者并非缺乏VEGF，相反，CLI患者在血液和患肢中的VEGF-A表达显著高于健康对照和间跛患者[38, 39]。另有一项研究显示，在CLI截肢的肢体中，远端肌肉样本的VEGF的表达和毛细血管密度显著高于近端样本，提示CLI中可能已存在有效的血管生成潜能[40]；然而，Palmer 等[41]进行的CLI肌肉活检的研究却未显示近、远端缺血肢体的VEGF表达存在显著差异。以上矛盾的结果一方面显示当前基于生长因子的基因疗法在基本的假设上，仍需要进一步讨论；另一方面显示患者接受生长因子补充治疗的效果可能存在极大的变异[42]。 2. 动脉生成可能不足 如今TA的概念已更明确地区分了血管生成和动脉的机制，目前认为，血管生成本身似乎不足以有效恢复血流，动脉生成是增强灌注并对缺血器官进行挽救的关键机制[9, 42]。动脉生成通常是由血流动力学力改变引发，如血压和剪切应力，这种力学变化引起内皮细胞激活，释放单核细胞趋化蛋白-1、细胞黏附分子等募集单核细胞，随后引发炎症与血管重塑，最终引起侧支通道直径和壁厚的增加。上述过程似乎无法通过简单的生长因子补充来实现。尽管临床前的动物实验和部分临床案例观察到了侧枝的建立（即动脉生成），但是仍未回答基因治疗是通过何种途径来实现动脉生成的。因此，通过基因疗法实现稳定的动脉生成，可能是TA在PAD治疗中获得成功应用的关键。 3. 动物模型存在缺陷 下肢缺血的基础研究高度依赖动物模型，造模通常选用啮齿类动物，施行单侧股动脉的结扎、切除，以及在此基础上的侧支清理[43]。尽管这些模型能够反映PAD的部分特征，但所有这些模型均为诱导的急性缺血并表现出较强的自我恢复能力，这和临床上PAD慢性病程以及进行性加重显著不同。此外，动物实验中常用年轻鼠，且通常没有糖尿病、高脂血症等合并症，这同样与PAD的流行病学特征具有显著差异[44]。有实验显示，老年鼠相对于年轻小鼠对缺血的耐受以及恢复能力更差[45, 46]。由于缺乏一些跨物种的分析的手段来对疾病模型和疾病本身进行内在相似性的评价，所以目前尚不清楚是否应该使用动物疾病模型和人存在的固有差异，来解释临床前的治疗效果和临床试验结果的不一致[9]。有研究尝试在动物中诱导慢性缺血，以产生更具临床相关性的PAD模型。Krishna等[47]在老年ApoE（-/-）小鼠股动脉放置了一个缩窄器来逐渐缩窄动脉，并在第二阶行股动脉切除，以实现慢性且更严重的缺血。不过，此类做法相对费时费力，并未得到广泛应用。 5. 给药策略仍需探讨 理论上，只有通过TA将主干血管延伸到远端肢体，才能带来具有改善意义的血流灌注，这就要求给药范围足够广，以沟通近、远端，最好能实现个体化给药[8]。Powell等[26]在HGF-0205试验中，根据影像学的结果，将基因药物在超声引导下递送到解剖学上缺血最重的区域。试验结果表明了改良注射方案的安全性，以及在疼痛缓解、溃疡愈合方面的优势。由于样本量较小，作者并未就注射方式的改变同其前一项的HGF-STAT试验进行讨论，以得出进一步结论。在pCK-HGF-X7的II期试验中，基因药物的注射部位根据造影结果而定，目标区域在血管闭塞的周围，作者将试验的相对成功部分归结于给药部位的改进[30]。以上试验对给药部位进行优化的尝试，似乎提示进行充分的成像和图像引导以递送基因到目标肌肉部位非常重要，但上述方案的优越性仍需进一步的研究来确认。 6. 有效性的评价 关于基因药物的有效性评价，早期的研究设定了截肢和全因死亡等宏大目标，然而后续的结果表明，上述目标无法通过基因治疗单独达成。在Collategene的III期试验开展不久，其申办方就修改了早期的计划，将原先的主要终点大截肢、全因死亡修改为疼痛缓解和溃疡愈合。后续其他的HGF基因药物也同样遵循了疼痛程度和溃疡大小的主要终点[30, 33]。这一转变有一定现实因素在，欧洲药品管理局关于治疗PAOD的药物临床研究指南提到，对于CLI患者的初级治疗目标是完全缓解疼痛、完全愈合腿部的所有坏死和溃疡以及生活质量的改善[30] TA的有效性需要进行两个层面的评价，一是客观的血管生成证据，二是临床表现的改善。尽管在临床前研究中，检测到了目的基因在体内的表达以及血管生成，但是在人体中，仍缺乏可靠的证据来显示成功的血管生成。大多数试验选择了TcPO2、ABI、TBI等作为血管生成的替代指标，然而，这些替代指标能否代表血管生成呢？即使能，相同的基因疗法，在II期和III期的临床试验中，出现了不一致的结果，是否意味着这些替代指标并不具备稳定性？客观、直观的血管生成证据对基因疗法的研发至关重要，应该说，这些困难一定程度上使得基因疗法的改进失去有效的指导，包括但不限于给药剂量、给药频率和给药范围 |
